一．服務(wù)內容
我公司提供的單細胞建庫測序技術(shù)服務(wù)是針對大規模細胞群體進(jìn)行表達譜分析，具體服務(wù)內容是利用10x Genomics微流控凝膠微珠技術(shù)對細胞懸液樣本中的500~10,000個(gè)單細胞進(jìn)行捕獲標記，同時(shí)對每個(gè)標記了的細胞中的RNA分子進(jìn)行獨立標記，建成用于illumina測序平臺的轉錄組測序文庫。建成的文庫將在illumina NGS測序平臺上進(jìn)行測序。最終利用10x Genomics的Cell Ranger對測序的結果進(jìn)行解碼，并針對單個(gè)細胞的表達譜差異對樣本細胞群進(jìn)行細胞亞群分析。
二．實(shí)驗操作步驟概述
1. 對單細胞懸浮液樣本進(jìn)行10x Genomics上機，制備油包水微滴乳濁液（GEMS）。
2. 油包水微滴乳濁液上PCR儀，進(jìn)行逆轉錄操作。
3. 破乳后進(jìn)行cDNA的回收、純化和擴增等操作。
4. 進(jìn)行片段化，末端修復，加A、加接頭，Sample Index PCR等后續文庫構建操作。
三．實(shí)驗結果
我公司完成10x Genomics建庫技術(shù)服務(wù)的過(guò)程中提供2個(gè)結果，分別是文庫質(zhì)檢結果報告和測序結果分析報告。
四．樣品要求及注意事項
1. 接收的樣品為單細胞懸液，如需組織解離，細胞分選等樣品制備需由客戶(hù)自行完成。
2. 單細胞懸液中，細胞間無(wú)粘連，無(wú)大于40uM的細胞碎片或其他顆粒物），單細胞懸液上樣前需過(guò)40uM細胞濾網(wǎng)（如Falcon cell strainer, REF 352340），確保不會(huì )堵塞微流控通道。
3. 細胞懸液中單細胞個(gè)數應大于預期實(shí)測細胞個(gè)數的2倍，如預期測到500個(gè)單細胞的數據，應提供至少1000個(gè)單細胞。
4. 細胞成活率應大于85%（用臺盼藍染色檢測）。
5. 上機單細胞懸液體積應小于30ul，建議細胞懸液濃度大約為1000個(gè)細胞/ul。
6. 如一次性上機多個(gè)樣品，第一個(gè)樣品制備完成到最后一個(gè)樣品制備完成時(shí)間相差不超過(guò)1個(gè)小時(shí)。
五．服務(wù)驗收標準
在細胞樣品達到上述要求的前提下，結果達到如下標準：
1.測序文庫合格：文庫檢測為單峰，且濃度高于3nM，體積大于25ul。
2.細胞捕獲效率達到50%：最終測序數據結果中的細胞數達到50%的起始細胞數。
六．服務(wù)承諾
1. 對于達到樣本要求的實(shí)驗，由于細胞計數誤差等實(shí)驗中存在的不確定性，實(shí)驗結果在上述標準的±20%以?xún)榷紴榭梢越邮艿姆秶Ｈ绻Y果在驗收標準20%以下的（即捕獲效率低于40%）可判定實(shí)驗失敗，公司將承擔該樣本的試劑耗材及服務(wù)費等全部費用。
2. 如果實(shí)驗過(guò)程中確認試劑耗材質(zhì)量的問(wèn)題，我公司負責向10x Genomics廠(chǎng)家申請賠付。（通過(guò)其它渠道采購的試劑耗材，我們也將協(xié)助客戶(hù)完成索賠）
3. 如果細胞樣品未達到要求，客戶(hù)可以選擇重新送樣或風(fēng)險上機，風(fēng)險上機將不能按照上述標準驗收。
七．常見(jiàn)問(wèn)題解答
1. 10x Genomics廠(chǎng)家的捕獲成功標準是65%，為什么貴公司承諾只有50%？
答：廠(chǎng)家測試捕獲效率用的是細胞系，細胞系樣品很容易制備成單細胞懸液，且能保證較高的細胞活性和完整性，而服務(wù)項目客戶(hù)很少用細胞系，大部分是用組織解離制備的細胞懸液，其細胞成活率相對較低，而且細胞計數的方法也會(huì )給結果造成一定偏差，因此我們把標準定在50%。
2. 建好的文庫送給測序公司上機前，文庫質(zhì)檢達不到測序公司的合格標準怎么辦？
答：測序公司出于免責的考慮，對客戶(hù)自建的文庫質(zhì)檢標準會(huì )比較嚴格，因此有可能我們庫檢沒(méi)問(wèn)題的樣品測序公司會(huì )判定為不合格。請把測序公司的文庫質(zhì)檢結果發(fā)送劉元和牛松，我們根據質(zhì)檢結果判定是否應承擔測序上機風(fēng)險。
3. 如果實(shí)驗失敗了，貴公司如何賠償？
答：兩種情況，一是如果因10x芯片或試劑導致實(shí)驗失敗，我們負責聯(lián)系廠(chǎng)家索賠，服務(wù)項目就更換試劑耗材重新做實(shí)驗。二是客戶(hù)細胞樣品合格、非風(fēng)險上機情況下建庫失敗，就不收取費用。實(shí)驗過(guò)程中的問(wèn)題，我們和客戶(hù)應本著(zhù)互信原則協(xié)商解決，實(shí)驗失敗我們不對客戶(hù)細胞樣品進(jìn)行賠償。
4. 除了利用10x Genomics的Cell Ranger進(jìn)行的標準分析外，貴公司還能提供哪些分析？
答： 基本分析
⑴ 提取測序序列 將bcl文件轉化為fastq，生成后期的樣本index序列文件，UMI序列及MRNA序列。
⑵ 序列比對注釋 將序列比對到相應的參考基因組的基因區域。
⑶ 按照細胞和基因組信息統計UMI，barcode信息，計算細胞和基因表達矩陣。
其他高級分析
⑴ t-SNE降維分析及聚類(lèi)：利用T分布隨機相鄰嵌入法(t-SNE)對數據降維處理，基于2維數據展示。利用聚類(lèi)算法對細胞進(jìn)行聚類(lèi)分析，聚類(lèi)后的細胞群體之間進(jìn)行差異表達分析。
⑵ 基因的富集分析：差異基因進(jìn)行后期的基因功能分析(GO和Pathway)。
