超微量與物種鑒定——藍藻，哪里逃
引言
藍綠藻，也稱(chēng)為藍藻，它們能迅速形成藻華，而造成巨大的環(huán)境問(wèn)題。藻類(lèi)大量繁殖會(huì )耗盡氧氣供應并降低湖泊和海洋中的光照水平，從而殺死魚(yú)類(lèi)和其他水生生物。此外，藍藻會(huì )產(chǎn)生有害毒素，例如肝毒素等，對動(dòng)物和人類(lèi)產(chǎn)生毒害作用。此外，藍藻已經(jīng)進(jìn)化了數十億年，可以在包括極端高溫、pH 值和鹽堿環(huán)境在內的各種氣候中生存和繁衍，表明這些有害的藻華 (HAB) 會(huì )在全球范圍內造成環(huán)境問(wèn)題。藍藻毒素的性質(zhì)和物種之間的豐度差異很大，因此快速、靈敏地鑒定這些物種的方法必不可少。事實(shí)上，有毒物種的早期檢測對于確保在這些 HAB 污染水源之前加以預防至關(guān)重要。Denovix超微量除了測量核酸方面表現優(yōu)秀，在物種鑒定方面也竭誠發(fā)光發(fā)熱！
Jaspreet K Sound等科研工作者首次展示利用原生質(zhì)譜（Native Mass Spectrometry）快速準確地識別來(lái)自不同水生環(huán)境的藍藻，該研究成果最終發(fā)表在雜志“Analytical Chemistry”上，題目為“Rapid Cyanobacteria Species Identification with High Sensitivity Using Native Mass Spectrometry” ,IF=6.982 [1] .
摘要
藍藻已經(jīng)進(jìn)化了數十億年，適應和生存在不同的氣候中，可迅速大量繁殖，迫害水生生物，在環(huán)境方面是一個(gè)巨大的挑戰。此外，許多藍藻會(huì )產(chǎn)生毒素，毒害其中的動(dòng)物甚至人類(lèi)。快速鑒定藍藻對于監測和預防有毒藻類(lèi)大量繁殖至關(guān)重要。在這里，我們首次展示了原生質(zhì)譜如何快速準確地識別來(lái)自不同水生環(huán)境的藍藻。通過(guò)監測藻膽蛋白（藍藻內豐富的蛋白質(zhì)復合物），創(chuàng )建了每個(gè)物種獨有的簡(jiǎn)單易懂的質(zhì)譜“指紋”。而且，我們的方法比當前的 MALDI-TOF質(zhì)譜方法靈敏10倍，這意味著(zhù)可以在水華形成之前使用該技術(shù)監測藍藻。總之，這些數據非常有望同時(shí)檢測和識別共存藍藻。
簡(jiǎn)介
1. 傳統上，藍藻鑒定依靠光學(xué)顯微鏡來(lái)區分物種并根據其形態(tài)對它們進(jìn)行分類(lèi)。然而，由于它們的高度生物多樣性，許多藍藻具有非常相似的形態(tài)，因此使用顯微鏡技術(shù)無(wú)法區分它們，特別是在具有相似形態(tài)的多個(gè)物種共存的情況下。
2. 分類(lèi)鑒定 對16S rRNA基因和DNA內部轉錄間隔區進(jìn)行額外的分子分析。但藍藻與其他微生物相關(guān)聯(lián)，獲得無(wú)菌藍藻培養物是一個(gè)困難且耗時(shí)的過(guò)程，并且在藍藻和微生物之間的共生關(guān)系很強的情況下幾乎是不可能的。
3. 宏基因組學(xué)能夠從微生物群落中對個(gè)體基因組進(jìn)行測序。然而，分析宏基因組數據需要專(zhuān)業(yè)知識，因此并未廣泛開(kāi)展。此外，在某些情況下，僅 16S rRNA 無(wú)法區分形態(tài)不同的物種。
4. 基因組測序的另一種方法是從藍藻獨特的功能蛋白質(zhì)成分中識別藍藻。基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜 (MALDI-TOF MS) 在該領(lǐng)域大獲關(guān)注，在臨床環(huán)境中也經(jīng)常用于識別各種細菌、真菌、和原生動(dòng)物。它快速且易于使用，但很少用于識別藍藻。遺憾的是，由于使用完整細胞 MALDI-TOF MS 識別的蛋白質(zhì)和光譜特征的數量，解釋數據可能很復雜，需要專(zhuān)業(yè)知識來(lái)確定光譜差異是否與存在的不同物種或藻類(lèi)物種內不同的蛋白質(zhì)豐度相關(guān)展示。此外，藍藻中的大多數蛋白質(zhì)的質(zhì)量在 2-20 kDa 范圍內，這使得光譜重疊很常見(jiàn)。以及，許多已鑒定的蛋白質(zhì)在物種之間具有相同的蛋白質(zhì)序列，因此無(wú)法通過(guò)該法區分它們。
原生MS應運而生
質(zhì)譜作為一種技術(shù)的速度、精度和可用性仍然可以利用。只是需要更簡(jiǎn)單的質(zhì)譜方法。在該文章中，Jaspreet K Sound等[1]科研工作者開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單的Native Mass Spectrometry原生質(zhì)譜 (MS) 方法，該法結合了 MALDI-TOF MS 技術(shù)在速度和易用性方面的優(yōu)勢。原生MS依賴(lài)于將蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)復合物保存在氣相中，使它們能夠在其生物學(xué)功能狀態(tài)下被檢測到。因此，原生MS可用于簡(jiǎn)化質(zhì)譜，因為當多種蛋白質(zhì)組合在一起形成蛋白質(zhì)復合物時(shí)，它們的質(zhì)量幾乎總是唯一的，因此光譜重疊最小。此外，使用最近開(kāi)發(fā)的高分辨率儀器，只需要在整個(gè)蛋白質(zhì)復合物的一個(gè)蛋白質(zhì)亞基中進(jìn)行小的氨基酸取代，就可以區分不同的蛋白質(zhì)復合物，從而區分一個(gè)物種與另一個(gè)物種。
藍藻中豐富的核心光合成分，稱(chēng)為藻膽體。藍藻細胞中多達50%的可溶性蛋白質(zhì)構成藻膽蛋白--本身就是藻膽體內的蛋白質(zhì)復合物。藻膽蛋白很容易進(jìn)行原生MS分析，藍藻基因組中幾乎所有的藻膽蛋白亞基氨基酸序列都是不同的，這意味著(zhù)理論上可以使用任何電噴霧電離MS方法輕松區分它們的蛋白質(zhì)質(zhì)量。當使用原生MS查看蛋白質(zhì)復合物水平時(shí)，所有物種都會(huì )產(chǎn)生獨特的質(zhì)譜。
在文章中，作者表明原生 MS 確實(shí)可以唯一地識別藍藻物種。通過(guò)對藍藻細胞裂解物的原生MS 分析，可觀(guān)察到與藍藻內獨特的藻膽蛋白復合物相對應的簡(jiǎn)單質(zhì)譜“指紋”。由于 Orbitrap 質(zhì)量分析器提供的高分辨率，檢測到的每個(gè)物種都彼此基線(xiàn)分離，沒(méi)有檢測到光譜重疊，這意味著(zhù)可以從非無(wú)菌培養物中識別每個(gè)藍藻物種。最后，作者比較了原生 MS 方法對藍藻檢測的靈敏度。數據顯示，體積相對較小（~50 mL）的藍藻可以在藻華形成之前以相當于熒光光譜技術(shù)的水平被識別，同時(shí)使用比現有 MALDI-TOF MS 方法少10倍的樣本。總體而言，數據顯示原生 MS 在快速鑒定藍藻物種方面具有非凡潛力。
物種鑒定實(shí)驗 作者使用 DS-11 分光光度計 (DeNovix) ，以 1(mg/ml)-1cm-1 的消光系數測量來(lái)自大螺旋藻、圓球藻、Gloeocapsopsis crepidinum、Nodularia harveyana、Spirulina subsalsa和Oscillatoria nigroviridis的提取物的總蛋白質(zhì)濃度，最終將提取物以等比例混合使得蛋白混合液最終濃度約為 0.065 mg/mL，隨即通過(guò)天然 MS 進(jìn)行分析。
別藻藍蛋白檢測限實(shí)驗 作者使用DS-11 分光光度計 (DeNovix) 進(jìn)行測量，并假設消光系數為 700,000 M –1 cm –1，別藻藍蛋白的濃度由其在652 nm處的吸光度確定。從0.72 g/L 的儲備溶液中，將別藻藍蛋白稀釋到10 mM 醋酸銨中，使其濃度分別為 50、10、5、2.5和1.26 mg/L，然后通過(guò)天然 MS 分析樣品。50和5 mg/L 別藻藍蛋白溶液還通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜在 220-750 nm 范圍內進(jìn)行監測，以 1 nm 的規則間隔讀取讀數。
原生 MS 物種鑒定的檢測限實(shí)驗 作者使用 DS-11 分光光度計 (DeNovix) 和 Bennett 和 Bogorad (1973) 中定義的方程，分別通過(guò)測量620和650 nm處的吸光度來(lái)確定裂解物的別藻藍蛋白和藻藍蛋白濃度。
超微量模式下，DS-11的蛋白檢測范圍0.04-1125mg/ml BSA；熒光模式下，蛋白檢測范圍是12.5ug/ml-1125mg/ml。DS-11僅為DS-11系列中的一款型號，不同型號擁有不同配置，不同檢測模式滿(mǎn)足不同檢測限要求，適用于超廣研究方向和使用者群體。感謝Jaspreet K Sound等科研工作者給予DS-11 分光光度計點(diǎn)亮藍藻獨特質(zhì)譜“指紋”的機會(huì )，希望Denovix品牌的超微量DS-11系列產(chǎn)品能夠參與點(diǎn)亮更多科研領(lǐng)域新發(fā)現，超微量之力，雖聽(tīng)起來(lái)綿薄，但我們竭誠貢獻！
圖Denovix超微量-不同型號與功能配置
DS-11系列主要特點(diǎn)：
·主機超微量模式始終如一的精度、終身免校。專(zhuān)利的SmartPath和Brigde testing技術(shù)保駕護航。
·無(wú)論是微量模式還是紫外熒光一體式：測量樣品的濃度范圍最寬，上下限均是行業(yè)內的翹首。
·根據樣品濃度不同，自動(dòng)變換測量光程。受專(zhuān)利保護(US9442009B2)。超微量模式：0.02mm自動(dòng)變換至0.5mm
·污染物分析功能SmartQC，污染物種類(lèi)鑒定報告。提示污染物，結合熒光模塊檢測。
·微量模式下，蛋白質(zhì)濃度無(wú)限制準確測量。無(wú)需稀釋至比色皿，微量即可檢測高濃度的蛋白質(zhì)。
·唯一一款整合了熒光光度計的超微量，拓展了用戶(hù)類(lèi)型。
篇幅有限，產(chǎn)品還有很多迷人細節，詳情請咨詢(xún)我司獲悉，歡迎預約試用樣機！
[1] Sound JK, Peters A, Bellamy-Carter J, Rad-Menéndez C, MacKechnie K, Green DH, Leney AC. Rapid Cyanobacteria Species Identification with High Sensitivity Using Native Mass Spectrometry. Anal Chem. 2021 Oct 26;93(42):14293-14299. doi: 10.1021/acs.analchem.1c03412. Epub 2021 Oct 17. PMID: 34657414; PMCID: PMC8552214.
