HoloMonitor是一款適用于細胞培養箱的無(wú)侵入實(shí)時(shí)活細胞成像系統，采用數字全息影像技術(shù)（digital holographic cytometry)，實(shí)現真正的無(wú)標記，無(wú)傷害全自動(dòng)活細胞成像。該儀器可以長(cháng)期穩定的在細胞培養箱或者低氧/缺氧小室運行并實(shí)時(shí)監視細胞的生長(cháng)及變化，還原最真實(shí)的細胞成長(cháng)狀態(tài)，在無(wú)任何人為干預的情況下獲得最可靠的生物學(xué)相關(guān)數據。
HoloMonitor活細胞成像系統使用數字全息成像技術(shù)，以激光為相干光源，利用干涉原理記錄物體波前信息的全息圖，通過(guò)數值重建來(lái)獲得被測樣品的相位和振幅信息完成三維數字重建。真正做到無(wú)標記無(wú)侵入的同時(shí)完成視野內所有細胞的3D成像，無(wú)需掃描，無(wú)光漂白，即可實(shí)現單個(gè)細胞和種群的3D成像以及提供完整的細胞形態(tài)學(xué)參數定量 ，可廣泛應用于細胞增殖，分化，遷移，凋亡，毒理等方面研究。
HoloMonitor的應用可以分為預制應用和分析應用，預制應用是已經(jīng)設置好的、簡(jiǎn)單易操作并且試驗結束后會(huì )自動(dòng)生成種群層面數據的應用。而分析應用是在種群數據的基礎上，分析單個(gè)細胞、一個(gè)集團細胞、一個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細胞或者某一幀細胞的具體數據的應用。
1.1細胞質(zhì)控
細胞計數、體積、面積、直徑、細胞密度。
1.2細胞繁殖
細胞計數曲線(xiàn)圖（cell/cm2）、貼壁密度曲線(xiàn)圖（%）。
1.3細胞計數
細胞數、平均細胞體積、平均細胞面積、體積與面積柱狀圖。
1.4細胞遷移
平均細胞遷移速度、平均細胞遷移距離
1.5劑量效應
細胞數、細胞密度、平均細胞體積
2.1單細胞追蹤
2.1.1運動(dòng)軌跡圖（細胞遷移、細胞運動(dòng)、運動(dòng)速度、運動(dòng)方向）
2.1.2細胞特征圖（體積、面積、不規則度厚度、質(zhì)地）
2.1.3細胞分裂次數、細胞周期
2.2傷口愈合
間隙合攏時(shí)間；細胞覆蓋面積；細胞前端運動(dòng)速度；單個(gè)細胞的遷移距離、遷移方向、運動(dòng)距離以及運動(dòng)速率。
2.3細胞形態(tài)
檢測30+細胞形態(tài)學(xué)數據，包括面積、厚度、體積、不規則度、質(zhì)地等。
1. 體積小，價(jià)格好
在設計之初，HoloMonitor活細胞成像系統追求緊湊性，讓其可以輕松地放入細胞培養箱中，并且在高濕度的環(huán)境下長(cháng)時(shí)間運行，在沒(méi)有人為干擾，不移動(dòng)細胞，不影響細胞培養環(huán)境的情況下實(shí)時(shí)監測細胞，最小化對細胞的干擾，最大化實(shí)驗的效率。相比傳統的“終點(diǎn)法”，實(shí)時(shí)監控獲得的數據更豐富，準確和靈活。
2. 好設置，易上手
HoloMonitor 活細胞成像系統操作簡(jiǎn)便，易于學(xué)習，無(wú)需復雜耗時(shí)的培訓，任何人都可以輕松掌握。同時(shí)的安裝簡(jiǎn)單明了，不需要任何復雜的設備，只需要一臺普通的電腦就可以穩定運行，真正的做到從開(kāi)箱到開(kāi)工只需4小時(shí)。
除此之外，HoloMonitor活細胞成像分析系統采用的自動(dòng)對焦技術(shù)極大的節省了調焦時(shí)間 ，同時(shí)配套的圖像分析App Suite軟件，能夠在完成多點(diǎn)圖像捕獲及視頻輸出的同時(shí)兼具高內涵數據分析，自動(dòng)生成實(shí)時(shí)結果，極大的簡(jiǎn)化了數據分析過(guò)程。
49%傷口愈合慢的人可能是糖尿病；23%的人存在自體免疫系統疾病，如類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節炎、狼瘡或青斑樣血管炎等。
傷口愈合實(shí)驗是最常見(jiàn)的研究細胞遷移的體外實(shí)驗，如何提供最準確的傷口閉合時(shí)間與速率一直是傷口愈合實(shí)驗的重中之重。HoloMonitor活細胞成像系統允許用戶(hù)在細胞培養箱中長(cháng)期不間斷的監測傷口愈合，并可以直接傷口愈合率的曲線(xiàn)圖以及傷口愈合視頻。為用戶(hù)提供更直觀(guān)更準確的傷口愈合分析。并且所有的數據都可以直接導出到Excel中，方便用戶(hù)隨時(shí)深入分析數據。
傷口愈合應用案例1
上皮損傷和上皮內肥大細胞（MC）增加是哮喘的特征。S. Mogren及其同事旨在確定MC介質(zhì)類(lèi)胰蛋白酶和蛋白酶激活受體2（PAR2）在上皮傷口愈合中的作用。研究表明，肥大細胞類(lèi)胰蛋白酶通過(guò)促進(jìn)人支氣管上皮細胞遷移促進(jìn)傷口愈合。S. Mogren及其同事采用HoloMonitor M4研究類(lèi)胰蛋白酶和PAR2刺激或抑制劑治療前后的細胞遷移、傷口愈合間隙閉合率和細胞形態(tài)學(xué)[1]。
圖1 在支氣管上皮細胞系 BEAS-2B的傷口間隙模型中，上皮內肥大細胞（MC）類(lèi)胰蛋白酶誘導細胞遷移、運動(dòng)和細胞速度增加。
傷口愈合應用案例2
標準2D細胞培養不模擬生理條件，導致研究結果并不總是適用于體內。本研究的重點(diǎn)是開(kāi)發(fā)細胞友好的方法，其中細胞在基質(zhì)凝膠中生長(cháng)，以創(chuàng )造生理相關(guān)的環(huán)境。Hellesvik及其同事使用HoloMonitor M4監測不同濃度基質(zhì)凝膠中的細胞形態(tài)、增殖、遷移和運動(dòng)[2]。
圖2 HoloMonitor M4監測單層3D制劑中的傷口愈合侵襲
免疫治療是指針對機體低下或亢進(jìn)的免疫狀態(tài)，人為地增強或抑制機體的免疫功能以達到治療疾病目的的治療方法。免疫治療的方法有很多，適用于多種疾病的治療。根據治療所用的制劑，可分為分子治療、細胞治療和免疫調節劑治療。
分子治療應用案例
具有免疫調節特性的新型佐劑和抗原遞送系統將過(guò)敏性Th2反應轉變?yōu)門(mén)h1或調節性T細胞反應，是過(guò)敏原特異性免疫治療所需的。本研究表明，200 nm大小的可生物降解聚（γ-谷氨酸）（γ-PGA）納米粒子（NP）是人類(lèi)單核細胞衍生樹(shù)突狀細胞（MoDCs）的活化劑。γ-PGA NP被未成熟的MoDCs有效內化，強烈刺激趨化因子和炎性細胞因子的產(chǎn)生，以及協(xié)同刺激分子和免疫調節介質(zhì)的上調（涉及低效T細胞啟動(dòng)）。這項研究表明，γ-PGA NP有望作為復雜的佐劑和過(guò)敏原傳遞系統用于過(guò)敏原特異性免疫治療。本研究使用HoloMonitor M2研究細胞形態(tài)[3]。
圖3 HoloMonitor M2可視化了 NP 內化過(guò)程中 MoDC 形態(tài)的變化。對收集到的顯微鏡數據的分析表明，細胞面積隨著(zhù)時(shí)間的推移而增加，而細胞不規則度和離心度，即衡量形狀偏離圓的程度，則有所下降（數據未顯示），說(shuō)明了細胞形態(tài)的顯著(zhù)變化。
細胞治療應用案例
體內腫瘤微環(huán)境不僅限于腫瘤細胞本身，還包括多種免疫細胞。在這項研究中，研究人員探討了中性粒細胞與小鼠腫瘤細胞共培養的細胞毒性作用。中性粒細胞要發(fā)揮其殺傷細胞的作用，就必須到達靶細胞，即腫瘤細胞。通過(guò)使用HoloMonitor 的細胞運動(dòng)和遷移分析，科學(xué)家們可以探索在不同條件下中性粒細胞接近癌細胞的能力是如何受到影響的[4]。
圖4 Holomonitor M4 成像系統監測細胞的運動(dòng)和遷移。
免疫調節劑治療應用案例
研究者發(fā)現，根據需要適當調節機體的免疫反應是一種有效的治療方法，比如可以阻止病原菌的感染、抑制自身免疫和炎癥反應以及引起自發(fā)引起癌癥患者的抗癌免疫反應。目前可用的免疫調節治療方式主要是用于抗感染，研究者們主要利用天然的免疫調節劑來(lái)糾正后天性或者先天性的免疫缺陷；最主要的是免疫佐劑，可以定向增強人類(lèi)機體的免疫效用，Ross以及同事探討了血管血紅素氧合酶-1（HO-1）的生理作用及其與系統性硬化癥（SSc）的心血管并發(fā)癥的相關(guān)性。結果表明，HO-1的抑制能顯著(zhù)降低內皮細胞的增殖和細胞運動(dòng)（遷移）。Ross以及同事使用HoloMonitor研究HO-1激活劑和選擇性抑制劑存在下內皮細胞的形態(tài)和功能特征[5]。
圖5.抑制HO-1降低HUVEC細胞的遷移、運動(dòng)和運動(dòng)速度。
參考文獻：
[1] Mogren S, Berlin F, Ramu S, et al. Mast cell tryptase enhances wound healing by promoting migration in human bronchial epithelial cells[J]. Cell Adh Migr, 2021,15(1):202-214.
[2] Hellesvik M, ?ye H, Aksnes H. Exploiting the potential of commercial digital holographic microscopy by combining it with 3D matrix cell culture assays[J]. Sci Rep, 2020, 10(1):14680.
[3] Broos S, Lundberg K, Akagi T, Kadowaki K, Akashi M, Greiff L, Borrebaeck CA, Lindstedt M. Immunomodulatory nanoparticles as adjuvants and allergen-delivery system to human dendritic cells: Implications for specific immunotherapy[J]. Vaccine, 2010, 28(31):5075-5085.
[4] Gershkovitz M, Fainsod-Levi T, Zelter T, et al. TRPM2 modulates neutrophil attraction to murine tumor cells by regulating CXCL2 expression[J]. Cancer Immunol Immunother, 2019, 68(1):33-43.
[5] Ross RL, Mavria G, Del Galdo F, et al. Downregulation of Vascular Hemeoxygenase-1 Leads to Vasculopathy in Systemic Sclerosis[J]. Front Physiol, 2022, 13:900631.
